明治11年。剣心（声：涼風真世）とともに志々雄（声：池田正典）の企む“京都破壊計画”阻止に向かった操（声：櫻井智）。しかし、志々雄と手を組んだ蒼紫（声：安原義人）によって翁が斬られるのを目の当たりにした彼女は、もはや想いを寄せる蒼紫を追い求めてはならないと心に決める。京都御庭番衆御頭となることを宣言した操は、蒼紫を倒すことを剣心に依頼。その一方で、京都大火を阻止し、さらにその奥にある志々雄の策略を未然に防ぐため、京都の防衛は操や薫（声：藤谷美紀）、弥彦（声：富永み～な）たち御庭番衆の肩にかかっていた。一方、大阪港へ向かう斎藤（声：成田剣）と左之助（声：うえだゆうじ）、剣心。そこには、巨大な船が停泊していた……。