紀元前480年。スパルタ王レオニダス（ジェラルド・バトラー）の元にペルシャ帝国からの遣いがやってきた。国を滅ぼされたくなければペルシャ大王クセルクセスに土地と水を差し出し服従をしろという使者。レオニダスはその場で使者を殺し、スパルタは100万の大軍を敵に回すことになった。開戦の許しを乞うためにレオニダスは司祭の元を訪れたが、託宣者は神のお告げであるとして出兵を禁じた。煩悶する王に王妃ゴルゴ（レナ・ヘディー）は毅然として言う。「自分の心に従いなさい」と。評議会の反対を押し切って戦う決心をしたレオニダスの前にスパルタの精鋭300名の兵士たちが集まった。レオニダスには戦略があった。海岸線の狭い山道に敵を誘い込めば大軍の利点を封じられる。そこをスパルタの盾で食い止めるのだ。作戦の地に到達した彼らの前に海岸線を埋め尽くすペルシャの大軍が現れる。しかし、スパルタの男たちに退却の文字は無い。考え抜かれた作戦の元、次々にペルシャ軍を倒していくスパルタ兵たち。対するペルシャ軍はモンスター級の怪人や、隠密部隊の不死軍団、巨大動物の投入と、様々な手段を使ってスパルタ軍を撃退しようとする。だが防御線をどうしても突破出来ない。その圧倒的な数の差にも関わらずスパルタ軍はペルシャ軍を撃退できるのではないかと、希望を抱くようになるレオニダス。しかし裏切りの影は前からも後ろからも忍び寄っていた。ペルシャ軍にスパルタを包囲できる裏道を教えた密告者。そして評議会にも王妃を騙して援軍を断とうとした者がいた。かくして援護も無いまま包囲され危機に陥るスパルタ軍。しかし彼らは屈することが無かった。死を覚悟し、ペルシャ王クセルクセスに槍を投げつけるレオニダス。一人でも多くの敵を倒そうと奮闘する兵士たち。結局圧倒的な数の前にスパルタ軍は全滅したが、決して屈服することの無いその精神は、後に残された者たちへと受け継がれていくのだった。