ニューヨークに住むラリー・デリー(ベン・スティラー）は、妻エリカに愛想をつかされて離婚、最愛の息子ニッキーは新しい父親にすっかりなつき、しかも失業中の身だった。自然史博物館の夜警の仕事に就いたラリーは、先輩の老警備員セシルから仕事を引き継ぎ、勤務初日を迎える。夜の12時、見回りを始めたラリーは、誰もいないはずの展示室から不思議な物音を聞く。音のする方へ行ってみると、なんとティラノザウルスの全身骨格が廊下の吸水機から水を飲んでいた。それだけでなく、モアイ像や原始人、動物たちや西部開拓時代のジオラマなど、博物館の展示物が次々と生き返り、勝手気ままに動き出していた。第26代アメリカ大統領セオドア・ルーズベルト(ロビン・ウィリアムズ）から、この博物館内の展示物は夜になると生命を得ると聞き、唖然とするラリー。そして夜明けになると、彼らは元の場所へと戻っていった。女性館員レベッカ(カーラ・グギーノ）に展示物について尋ね、歴史を勉強し、備品や秘密兵器を携えてラリーは夜に備える。二日目の夜、準備の甲斐がありティラノザウルスやジオラマ対策も万全だったが、猿のデクスターに鍵束を取られてまたも博物館は大混乱に。惨状を見たボスのマクフィー博士はラリーに首を宣告。しかもその場をニッキーに見られてしまう。懸命の説得で首をまぬがれたラリーは、ニッキーをその晩、博物館に招待して信じられない光景を見せてやろうとする。奇しくもその夜、ある計画が企てられていた。セシルが警備員仲間とともに、博物館の希少な骨董品を盗もうとしていたのだ。ラリーは展示物たちと力を合わせてセシル一味を退治し、ニッキーの尊敬も勝ち取るのだった。