ある朝、人間の犬アレルギーを解消するための新薬を完成させようとしているブロディ教授（ジェフ・ゴールドブラム）一家の愛犬バディが、世界征服を企む邪悪猫ティングルス（声＝ショーン・ヘイズ）一派に誘拐される。一時的な休戦状態にあった猫と犬の戦いはこの事件を機に再発。危機を知った犬たちは一家にトップ・エージェント犬を送り込もうとするのだが、ちょっとした手違いで、何の知識もないポケット・ビーグルの子犬ルー（声＝トビー・マグワイア）を派遣してしまう。ルーに任務を遂行させるべく、トップ・エージェント犬ブッチ（声＝アレック・ボールドウィン）、コンピュータの達犬ピーク（声＝ジョー・パントリアーノ）、諜報犬のサム（声＝マイケル・クラーク・ダンカン）、謎めいたホームレスの雌犬アイビー（声＝スーザン・サランドン）がサポート。ブロディー家の一人息子スコット（アレクサンダー・ポラック）との間にも、かけがえのない絆が生まれつつあった。そんな時、ルーの悪戯をきっかけに、ブロディー教授がついに新薬を完成させる。一方、猫たちは激しい攻撃で着々と犬たちを陥れていくが、最後にドジをやってしまい、結局、犬が勝利する。こうして犬と人間が戯れる、猫の脅威のない平和な世界が訪れるのであった。